肺癌是高死亡率的恶性肿瘤，其致死率占全世界癌症的近五分之一。近年来，以PD-1/PD-L1为代表的免疫检查点抑制剂的兴起，改变了肺癌的治疗格局。由于肿瘤微环境的复杂性、高度异质性及其对抗肿瘤免疫和癌症免疫逃逸的影响，单一免疫标志物的预后价值有限。研究者通过多色免疫组化（mIHC），对98例非小细胞肺癌（NSCLC）患者免疫微环境中四种关键免疫标志物和检查点分子（PD-1、PD-L1、抗肿瘤T细胞标志物CD8和免疫抑制Treg标志物FOXP3）的表达进行解析，以评估它们在NSCLC中的潜在预后和分层价值，最新研究结果发表在Frontiers in Immunology（IF：7.561）。 

主要研究发现

与瘤内相比，瘤周腔室中浸润的CD8+和FOXP3+免疫细胞密度较高，结合免疫细胞亚区特异性浸润模式和PD-1/PD-L1表达可用于预测患者预后。

对CD8/FOXP3、PD-1和PD-L1免疫检查点的表达进行无监督聚类分析，结果提示CD8/FOXP3和免疫检查点(PD-1和PD-L1)的低表达可能是患者对靶向Treg细胞治疗应答的标志。

基于多因素Cox回归建立风险评分模型，风险评分为NSCLC预后的独立预测因素。

研究结果

1、利用多色免疫组化（mIHC）解析NSCLC组织中肿瘤免疫微环境表型

为了探究NSCLC原位驻留和浸润性免疫细胞的特征，研究者建立并优化了mIHC的工作流程，以评估CD8+T细胞、FOXP3+Treg细胞、PD-1+细胞和PD-L1+细胞。PanCK阳性用于确定肿瘤成分。使用inForm软件进行光谱拆分后，将图像分离为其固有的荧光团，并将相应的图像可视化(图1A)。对组织微阵列（TMA）样本进行6色mIHC染色来评估CD8+ T细胞、FOXP3+Treg细胞、PD-1+和PD-L1+细胞在肿瘤组织及癌旁组织中的密度(图1B)。然后，通过inForm评估肿瘤区和间质区的表型，其中肿瘤区由PanCK阳性区域定义(图1C)。另外，通过一种模式识别算法，将瘤周和瘤内区域的免疫细胞进行量化，以分析NSCLC患者瘤周和瘤内区域的免疫微环境表型(图1D)。

图1. 使用六色mIHC评估NSCLC的微环境

2、NSCLC中高密度肿瘤相关免疫细胞与免疫抑制表型的相关性  

研究者根据样本来源，将NSCLC样本分为肿瘤组织和癌旁正常组织两组，使用六色mlHC检测两组样本中肿瘤相关免疫细胞和免疫检查点的特征，发现CD8+、FOXP3+和PD-1+细胞密度在肿瘤组织中明显更高 （p <0.01），CD8/FOXP3比值在癌旁正常组织中明显更高（p <0.0001）。而PD-L1+细胞水平在肿瘤组织与癌旁正常组织间无显著差异（p=0.067）。鉴于PD-1/PD-L1高水平通常与患者较差预后相关，他们又分别根据PD-1+细胞密度中值和PD-L1表达水平对NSCLC样本分组，比较两组间CD8+和FOXP3+的细胞密度或水平，发现PD-1高表达组中，CD8+ T细胞（p<0.0001）和FOXP3+ Treg细胞（p<0.001）密度显著升高；PD-L1高表达组中，CD8+ T细胞（p=0.0192）和FOXP3+ Treg细胞（p=0.0201）水平显著升高。这提示CD8+和FOXP3+细胞浸润与PD-1/ PD-L1高表达有关，表明在免疫抑制亚型中，可能会发现高浸润CD8+ T细胞，导致Treg浸润增加，并由肿瘤以适应性方式诱导更高的PD-1/PD-L1表达。

3、肿瘤周围和肿瘤内亚区NSCLC样本表现出不同的免疫亚群和检查点特征

研究者采用热图分析和聚类分析来评估肿瘤周围和肿瘤内亚区不同NSCLC样本之间的潜在相关性。根据CD8+、FOXP3+、PD-1+和PD-L1+细胞的水平，可以区分瘤周组织和瘤内组织的独特免疫亚区。通过比较同一患者瘤周和瘤内组织的免疫亚群和检查点，发现瘤周区域CD8+、FOXP3+和PD-1+ T细胞群体比例显著升高（P < 0.01-0.0001）（图2D-F），而PD-L1+细胞比例无显著差异（图2G）。瘤周组织中细胞毒性T细胞数量较多，可能代表了肿瘤边缘的某种反应，促使研究者进一步研究肿瘤周围亚区。

图2. 免疫细胞亚群在瘤内和瘤周的差异

4、聚类分析证实了联合考虑NSCLC免疫亚群和检查点具有良好的预后价值

采用无监督分层聚类分析标记物，研究者评估了瘤周亚区CD8+、FOXP3+、PD-1+和PD-L1+细胞密度对NSCLC预后的不同影响。整个患者队列的Kaplan-Meier分析显示，单独的CD8+ T细胞、FOXP3+ Treg细胞、PD-1+细胞和PD-L1+细胞密度对患者生存没有显著的预后价值（图3A-D）。基于免疫细胞密度的无监督聚类分析，鉴定出3个生存期差异显著的簇（簇1: CD8/FOXP3比值中等，PD-1和PD-L1高表达；簇2: CD8/ FOXP3比值低，PD-1和PD-L1低表达；簇3:CD8/FOXP3比值高，PD-1和PD-L1低表达），其中簇3的OS显著优于簇1和2 （P =0.0486）（图3E, F）。基于聚类结果，分层患者可为抗PD-1/PD-L1治疗提供指导（簇1）,而簇2可能受益于针对Treg细胞的策略。

图3. 根据CD8+、FOXP3+、PD-1+、PD-L1+细胞密度对患者进行预后分层

5、高CD8/FOXP3和高PD-L1表达与亚组患者更好的生存预后相关

研究者进一步评估了3个亚组患者瘤周CD8+、FOXP3+、PD-1+和PD-L1+细胞密度水平及CD8/FOXP3、CD8/PD-1和CD8/PD-L1细胞比值（图4A-E）的预后价值。与高水平的肿瘤浸润性CD8+ T细胞被认为是多种癌症类型（包括NSCLC）的良好生存预后因子不同，本研究中肿瘤浸润性CD8+ T淋巴细胞与患者生存在任何患者或亚组中均无显著相关性（图3A）。CD8/FOXP3比值高可提高簇3中的患者生存率，但在其他亚组中则没有（图4B）。而CD8/PD-1比值和CD8/PD-L1比值在任何亚组患者中均无预后价值。这些结果表明，CD8水平相对于FOXP3水平在亚组患者中具有预后价值。此外，FOXP3高表达的簇2（低CD8/ FOXP3比值）患者生存率较低（图3C），这可能表明靶向FOXP3+ Treg细胞可以改善该簇患者CD8+细胞的功能，有利于该簇患者的预后。PD-1的表达在3个亚组中均无预后价值（图4D）。而单个PD-L1水平在簇3中显示了预后价值，在簇1中却没有，且高PD-L1表达与更好的生存结果相关（图3E）。这些结果可能表明，CD8/FOXP3比例高，PD-L1表达适度，可以平衡肿瘤反应性和免疫抑制微环境的影响，从而获得更好的生存结局。

图4. 根据CD8、CD8/FOXP3、FOXP3、PD-1、PD-L1表达水平分层的亚组患者总生存率(OS)

6、与EGFR状态相关的PD-1/PD-L1调控的免疫抑制

有研究发现EGFR突变的NSCLC组织过表达PD-L1，且肿瘤PD-L1表达与肺腺癌中EGFR的突变状态和不良预后呈正相关，研究者进一步评估了PD-1/PD-L1表达是否与EGFR或ALK突变状态联合调控免疫抑制。簇1（18.92%）和簇2（14.63%）具有免疫抑制的患者比簇3（0%）患者有更多的EGFR突变（图5A），但ALK突变在簇1（16.22%）、簇2（17.07%）和簇3（10.53%）中没有任何影响（图4B）。数据表明，EGFR突变状态与高TIL密度和高PD-1/PD-L1表达（簇1）以及低TIL密度和低PD-1/PD-L1表达（簇2）相关。这一结果与之前报道的EGFR突变NSCLC患者高PD-L1表达形成对比。此外，研究者还进一步评估了基因突变患者和野生型患者的免疫细胞的预后价值，结果表明，在野生型亚组患者中，只有CD8相对于FOXP3水平具有预后价值，提示CD8/FOXP3比值具有重要的预后价值。

图5. 免疫抑制状态与EGFR或ALK突变的关系

7、基于多因素Cox回归判断预后的免疫风险评分模型的建立

研究者建立了可提供线性风险测量的免疫评分模型：风险评分=0.391*CD8+(-0.374)*FOXP3+(-0.396)*PD-1+0.272*PD-L1+(-0.269)*CD8/FOXP3+(-0.473)*CD8/PD-1+0.181*CD8/PD-L1，并尝试使用TCGA队列来验证由TMA结果构建的风险评分模型，结果与TMA数据结果相似，高危评分与生存预后差有相关性(P=0.0558)。该评分以肿瘤周围的亚区内的部分成分为免疫变量，基于其间复杂的相互作用来反映NSCLC患者的预后。此外，研究者还进行了时间依赖性ROC分析，以评估风险评分在判断NSCLC患者预后方面的敏感性和特异性。ROC曲线分析结果显示，1年、3年和5年OS AUC值分别为0.784、0.698和0.722。研究者进一步分析了临床病理特征（年龄、肿瘤分期、淋巴结分期、AJCC分期）与风险评分之间的关系。结果显示，高淋巴结分期（P = 0.03）和AJCC分期（P = 0.02）患者的风险评分明显高于低淋巴结分期和AJCC分期，表明风险评分模型具有重要的预后价值。

总结与提示

本研究从评估NSCLC预后出发，通过mIHC检测NSCLC组织中肿瘤相关免疫细胞和免疫检查点的特征，进一步通过聚类分析发现CD8/FOXP3比值较高，免疫检查点PD-1和PD-L1表达较低，且无EGFR基因突变，可作为NSCLC预后良好的预测标志物。根据CD8/ FOXP3比例、PD-1和PD-L1免疫检查点表达进行聚类，并根据不同预后标志物将患者分层，以指导肿瘤免疫治疗(抗PD-1/PD-L1治疗或靶向Treg细胞治疗)。此外，研究者在此基础上建立了一个有价值的风险评分模型来判断NSCLC患者的预后。未来的研究将聚焦于高度异质性的微环境和CD8、FOXP3、PD-1、PD-L1等免疫检查点表达的空间分布，更好地分层患者，指导NSCLC患者的临床免疫治疗。

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参考文献：Yang Y, Yang X, Wang Y, et al. Combined Consideration of Tumor-Associated Immune Cell Density and Immune Checkpoint Expression in the Peritumoral Microenvironment for Prognostic Stratification of Non-Small-Cell Lung Cancer Patients. Front Immunol. 2022;13:811007. Published 2022 Feb 10. doi:10.3389/fimmu.2022.811007