蛋白质组学

蛋白质组学（Proteomics）是在1994年由Marc Wikins首先提出的新名词，蛋白质组被定义为细胞、器官或组织型的蛋白质成分的总称，而蛋白质组学是研究这些成分在指定的时间或特定的环境条件下的表达。具体来说是对不同时间和空间上发挥功能的特定蛋白质群组进行研究，即在蛋白质水平上探索其作用模式、功能机理、调节调控，以及蛋白质群组内相互作用。其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。因为蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。

Olink蛋白质组学技术

针对每个待检蛋白质，Olink设计了一对抗体，抗体上偶联有特定的DNA单链，当这对抗体结合目标蛋白质后，处于邻位的两条DNA单链可互补结合并经酶延伸形成双链DNA模板，巧妙地将蛋白质定量转换为DNA定量，最后利用微流控qPCR或NGS测序进行定量检测。

Olink性能特点与技术优势 

在PEA反应中，PCR的指数扩增特性被用来实现对检测信号对放大，提供较传统的酶联免疫吸附试验（ELISA）更佳的检测灵敏度。因此只需极小的样品量就可以同时测量大量的蛋白质，将显著地促进针对有限及珍贵样本的研究，例如使用来自临床队列或生物样品库的人类样本。此外，PEA中的抗体偶联的核酸单链只有在一一正确配对形成DNA双链时才能被检测出，这确保了即使在超多重水平下也有超乎寻常的特异性。

性能情况

研究流程

Olink技术流程

1）样本孵育后，临近探针特异性结合目标抗原；

2）探针寡聚体互补并在DNA聚合酶作用下延伸，这将创建一个双链DNA“条形码”，该条形码对于特异性抗原来说是唯一的，并且在数量上与靶蛋白质的初始浓度成正比；

3）通过微流控qPCR对扩增子进行定量，或者通过在扩增子上加入接头进行NGS测序。

Olink生信分析流程与信息分析示例

数据质控

数据分析

分析结果示意图

样本NPX值总览

IQR质控

单一分组蛋白表达量热图

蛋白相关性分析

循环蛋白质组检测产品

样本要求

产品服务列表

产品服务流程

项目周期

标准流程从样本接收到数据交付，运转周期约为 2个月（40 个工作日），选择定制化信息分析条目需额外评估项目周期。

交付指标和售后服务

1. 根据合同规定完成分析。

2. 提交项目结题报告文档，说明项目完成情况。

3. 分析过程中产生的项目结题报告、下机原始数据以及相关生物信息分析结果文件。如果数据量小于 100G，使用阿里云提供；因网络等原因无法顺利下载的，可提供移动硬盘传输；如果数据量大于 100G，所有数据将会使用移动硬盘传输。

4. 数据交付后 6 个月内，提供免费的项目咨询服务。

5. 最终数据提供后，可继续保留数据 3 个月，如需延长数据保存时间需做费用评估。

产品服务优势

Olink的技术优势总结

案例分析

血浆蛋白质组学助力预测免疫检查点阻断剂耐药的全新生物标志物

研究背景：

免疫检查点阻断剂（Immune Check- point Blocker, ICB）现已广泛应用于肿瘤治疗。但很多病人尚未从中获益，主要归因于人群的免疫检查点阻断剂抵抗。随着基因组学的快速发展，蛋白质研究已成为深入理解实时生物学的前沿平台。为解决ICB的潜在毒性，并仅针对可获益病人进行价格不菲的治疗——开发可靠针对ICB抵抗的新型生物标志物，至关重要。

研究思路：

本研究基于Olink技术对两个独立接受ICB治疗的癌症患者前瞻性队列基线血浆样本（发现队列n = 95，验证队列n = 292）进行了无偏血浆蛋白质组分析。然后，研究者通过Cox比例风险模型研究了血浆蛋白质水平与临床获益率、无进展生存期(PFS)、总生存期(OS)以及与PD-L1表达水平、CD8+T细胞浸润密度、三级淋巴结构TLS的相关性。

研究结论：

血病抑制因子(LIF)可独立于PD-L1表达状态预测免疫检查点阻断剂治疗癌症患者的效果，且与CD8+T细胞浸润密度具有相关性。此外，研究者还发现白血病抑制因子（LIF）可独立于PD-L1表达状态预测免疫检查点阻断剂治疗癌症患者的效果。研究者通过多重免疫组织化学对59例患者的匹配肿瘤组织样本进行了PD-L1表达评分（下图a）和CD8+T细胞浸润密度评估（下图d），并与LIF水平一起比较临床结局的相关性。其中，20例患者(33.9%)的PD-L1阳性肿瘤比例评分(TPS)≥1%，39例患者(66.1%)<1%。然而，PD-L1阳性和阴性肿瘤患者的外周LIF水平相似（下图b），且高水平(46.1%)和低水平循环LIF(55%)的肿瘤患者中PD-L1阳性肿瘤比例相似（数据未显示）。临床结局相关性上，无论PD-L1表达状态如何，具有低水平循环LIF特征的肿瘤患者具有更好的结局。

常见问题 FAQs

▪ 技术相关

1. Olink的检测中，每个样本需要做多少次重复？

Olink对样本的重复次数没有要求，除非是客户要求的。通常来说，生物学重复带来的变异超过技术变异，所以客户们更专注于使用不同的样本而不是做重复实验。Olink的主要的检测Panel的板间CV<10%。

2. Olink检测的灵敏度？

Olink在开发验证各Panel时，用2倍稀释的标准曲线去计算了LOD, LLOQ, ULOQ 以及 hook。

已证实：PEA技术的灵敏度高于ELISA检测，可至fg/ml。Olink使用EDTA 血浆样本充分验证了生理病理的蛋白水平。

3. Olink的检测会受到内源性干扰吗？预计会有什么基质效应呢？

在进行Olink检测Panel验证的时候，Olink评估了来自异嗜性抗体的潜在内源性干扰，例如 人抗鼠抗体 (HAMA) 和类风湿因子，以及特定的干扰物质（溶血物、脂质和胆红素）。验证过程中没有观察到明显的测定干扰。

4. 什么是动态检测范围(Dynamic Range)？

动态检测范围是指介于检测下限和检测上限范围。在这个范围内，检测的准确度和精准度更好。

5.  用Olink技术进行的蛋白质组检测与传统的DNA测序的主要差别是？

Olink使用NGS（二代测序）作为测量样本中特定蛋白质生物标志物的相对浓度。在样本和文库制备过程中，会产生对标每个蛋白质生物标志物的特定序列（DNA条形码）的短DNA链。测序后，这些特定序列的DNA链的技术与原始蛋白质生物标志物的浓度成正比。

▪ 产线相关

1. 在Olink的每个检测试剂盒中可以检测到多少种蛋白质生物标志物？

对于Olink的Target系列而言，除了可以检测到的内部参照， Target 96 和Target 48可以分别实现92个/45个不同靶标蛋白的检测。

2. 从哪里可以获取关于Olink检测Panel中的某个特定蛋白质的更多的信息？

可以通过访问一些公开公共的资源，例如Human Protein Atlas网站、UniProt数据库等。

3. 一个Olink Explore系列的试剂盒可以检测多少蛋白质生物标志物？

除去对照， 一个Explore 384 试剂盒包含了368种蛋白质生物学标志物，而一个 Explore 3072的试剂盒，包含了8个 Explore 384的检测Panel，总共可以平行检测2944个蛋白质。

4. 在不同的Explore 384 Panel中，是否有重叠的检测？为什么？

不同的Explore 384 Panel中都有IL6, IL8和TNF-α 检测。它们用作额外的对照步骤。

5. 定制的Focus Panel可检测的靶标数目的上限和下限是多少？

目前，Olink Focus Panel可检测的靶标数目的上限是21、下限是1。但开发靶标上限和下限的检测Panel的价格是一样的。

6. Focus Panel中的靶标蛋白可以不是Olink靶标库中的吗？

不行，仅有Olink靶标库中的蛋白质可做Focus Panel。

7. Olink Panel中的靶标蛋白是如何选择的呢？

在设计新的Panel时，Olink从广泛使用的公共访问生物信息学数据库中收集信息，包括 UniProt、Human Protein Atlas、Gene Ontology (GO) 和 DisGeNET。

先选择已知和探索性生物标志物的组合并评估合适抗体的可用性，然后还需要通过Olink严格的验证测试和要求。 选择过程和Panel组成是根据各个领域专家的意见共同制定的。

8. Olink的Panel中用的是什么抗体?

Olink各检测Panel用的都是抗原纯化的多克隆或单克隆抗体或者是两者的组合。绝大部分都是商业化的抗体。

▪ 样本相关

1. Explore和Target系列可接受的样本类型有哪些？

对于Explore系列，Olink在人类血浆血清样本上进行了充分地验证。

对于其他类型的样本，例如组织和细胞裂解物、细针活检、外泌体、微透析液、支气管肺泡灌洗液、细胞培养基、干血斑、滑液、脑脊液、斑块提取物、尿液、唾液等等 ，需在实验室内进行验证后再进行检测。

2. 收样体积

虽然Explore 384仅需1μL/样本、Explore 1536需要 4μL/样本用于检测，但由于使用各类移液设备，需要考虑到额外的死腔体积，因此我们要求每个96孔板中最少要保留10μL/样本。

考虑到运输过程中可能会伴有液体蒸发等，我们要求运输时，最低样本体积为50μL/样本。如有必要，我们可以返还剩余样本给您。

▪ 服务相关

1. 各Olink panels中需要提供的样本数目是多少?

对于Olink Explore系列产品和Olink Target 96 产品, 针对一块96孔板，需要凑齐88个样本。对于Olink Target 48 产品, 针对一块48孔板，需要凑齐40个样本。 

附录：Olink-Target 96-系列Pane的检测靶标列表